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          一區,IF=25.841|云序客戶白金期刊成果,外泌體竟是心肌損傷“罪魁”!
          日期:2022年02月16日    來源:
          外泌體是由活細胞分泌的直徑約為30-150nm的小囊泡,具有典型的脂質雙分子層結構。近年來,越來越多的證據顯示外泌體可以作為細胞間信息傳遞的媒介發揮作用。云序客戶同濟大學東方醫院的周曉慧、范慧敏團隊在Journal of Extracellular Vesicles雜志上發表的“Myocardial ischemia-reperfusion induced cardiac extracellular vesicles harbour proinflammatory features and aggravate heart injury”文章,通過云序生物提供的外泌體miRNA測序,揭示了缺血再灌注(IR)中存在的IR-EVs-miR-155-5p-M1型極化軸,可導致局部和全身炎癥,并提出GW4869抑制EVs可能是一種有前途的IR損傷治療策略。
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          發表期刊:Journal of Extracellular Vesicles
          發表時間:2021年2月23日
          樣本類型:小鼠缺血—再灌注(IR)心臟外泌體
          研究方法外泌體miRNA測序RT-qPCR
          文章鏈接Myocardial ischemia-reperfusion induced cardiac extracellular vesicles harbour proinflammatory features and aggravate heart injury
           
          研究思路

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          研究背景

          急性心肌梗死是一個發病率和死亡率較高的全球性問題。快速恢復冠狀動脈血流是減少心肌梗死和改善心功能的最有效策略。然而,再灌注會導致不可逆的心肌損傷,被稱為心肌缺血-再灌注(IR)損傷。目前,IR損傷的機制尚不明確,仍缺乏有效的治療方法。炎癥是維持體內平衡的基本生物學過程,但過度的炎癥反應會導致組織損傷。巨噬細胞是心肌梗死觸發的炎癥級聯反應的重要效應因子和調節因子,其中M1型巨噬細胞是促炎類型,在促炎細胞細胞因子的吞噬和分泌中起重要作用。細胞外囊泡(EVs)是一種具有雙層脂膜的細胞來源的納米級囊泡,越來越多的證據證實了EVs作為細胞間通信載體的重要作用。最近的研究揭示了EVs在炎癥調節中的功能,并證實了EVs通過調節巨噬細胞的極化參與各種疾病的發展,然而IR誘導的EVs作用仍然有待披露。大量研究表明非編碼RNA在心血管疾病中發揮重要作用,特別是miRNA。心臟IR-EVs和EVs傳遞的miRNA是否以及如何在IR損傷中發揮其作用,目前尚不清楚。

          研究內容
          1、IR引起心臟EVs改變
          通過透射電鏡觀察來自對照組與IR損傷心臟的EVs,典型的四種外泌體標記物CD63、CD9、Alix和TSG101在兩組中均表達,IR損傷增加了EVs的釋放量,并沒有顯著調節EVs的大小。
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          2、IR-EVs加重了IR誘導的心臟損傷,促進IR損傷心臟中巨噬細胞的M1型極化
          為了進一步闡明IR-EVs在心臟IR損傷中的作用,將IR-EVs用DiR標記后注射到sham組與IR損傷組心臟中。生物發光成像結果顯示,IR-EVs在注射后24h可保留在心臟內與注射PBS的組相比,IR-EVs顯著損害心臟功能,增加梗死面積。說明IR-EVs會加重IR誘導的心臟損傷。
          巨噬細胞極化在IR誘導的心臟損傷和修復中起重要作用。因此研究人員試圖確定IR-EVs是否調節巨噬細胞極化。結果顯示,IR-EVs顯著增強IR損傷心臟中M1極化標記基因NOS2和促炎細胞因子IL1β、IL6和TNFα表達,而與M2極化相關的Arg1、MRC1、Fizz1和IL10的mRNA水平則大幅下降。增強了IR損傷小鼠心臟和循環白細胞中Ccl2、Ccl4、Cxcl4、Cxcl1和Cxcl2的表達,降低IR損傷小鼠循環白細胞中IL10表達。心臟組織免疫熒光染色實驗顯示IR-EV輸血促進了CD45+炎癥細胞和CD45+F4/80+巨噬細胞的浸潤。流式細胞術進一步證實了IR-EVs能夠加劇局部炎癥,促進巨噬細胞滲入損傷心臟,并促進其M1型極化。
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          3、抑制EVs的產生可減輕心肌IR損傷,減輕局部炎癥
          研究人員使用GW4869(外泌體抑制劑)探索抑制EVs對IR誘導的心肌損傷的影響。結果顯示,注射GW4869處理能夠顯著改善了IR損傷小鼠的心臟功能,減少梗死面積,降低心肌酶水平,并且抑制了NOS2、IL1β、IL6和TNFα的表達。與IR小鼠相比,GW4869處理的IR小鼠心臟中促炎趨化因子Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2的表達減少,并且減少了IR損傷心臟中CD45+炎癥細胞和CD45+F4/80+巨噬細胞的浸潤。GW4869抑制IR-EVs對心臟的保護作用進一步表明IR誘導的EVs參與心臟IR損傷,促進炎癥反應增強。
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          4、IR-EVs可在體外編程巨噬細胞M1型極化
          為了進一步闡明IR-EVs對巨噬細胞極化的作用,研究人員用原代腹腔巨噬細胞和IR-EVs進行體外共培養。結果表明,IR-EVs能夠促進M1型極化相關基因NOS2、IL1β、IL6和TNFα的表達,并且表達水平隨著IR-EVs濃度的增加而增加。降低M2型極化相關基因MRC1、Fizz1和IL10的表達,提高促炎因子IL1β、IL6和TNFα的蛋白水平,并且趨化因子Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2的mRNA表達水平也顯著升高。實驗結果表明,IR后大量IR-EVs的釋放可能是促進趨化因子和炎癥因子產生的因素之一。此外,IR-EVs處理顯著提高了吞噬相關基因的表達,并促進了腹腔巨噬細胞PMφ和骨髓源性巨噬細胞BMDMs的吞噬活性。
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          5、MiR-155-5p是IR-EVs介導巨噬細胞極化的候選效應因子
          EVs通過傳遞miRNA而被稱為細胞間的通信載體。因此,研究人員對來自sham和IR組的心臟EVs進行miRNA測序(3v3),來確定候選miRNA效應因子。鑒定獲得的差異表達的miRNAs,并對在IR-EVs中前十個高表達的miRNA進行qPCR驗證。
          共聚焦顯微鏡結果顯示,IR-EVs可以被巨噬細胞攝取。為了進一步確定候選miRNA,在與IR-EVs共培養的PMφ中檢測高表達前三的miRNA。與S-EVs共培養的巨噬細胞相比,與IR-EVs共培養的PMφ中miR-155-5p表達量顯著上調,并且miR-155-5p表達量與IR-EVs呈正相關。因此,推測miR-155-5p可能是IR-EVs中具有關鍵作用的候選效應因子。
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          6、IR-EVs中miR-155-5p通過IAK2/STAT1通路促進巨噬細胞M1型極化
          在與IR-EVs共培養的巨噬細胞中,研究人員證實了IR-EVs濃度和NOS2表達正相關,miR-155-5p表達和NOS2表達正相關。轉染miR-155-5p 模擬物能增加促炎因子表達,降低抗炎細胞因子IL10表達。此外,心臟內給藥agomiR-155能夠重現IR-EVs促炎作用,IL1β、IL6和TNFα表達增加,IL10表達降低。
          已有研究表明,JAK/STAT1是巨噬細胞M1型極化的重要調控通路。IR-EVs能夠顯著提高PMφ中總JAK2和磷酸化JAK2的表達下游分子STAT1也被激活。在巨噬細胞中加入miR-155-5p模擬物也同樣激活了JAK2/STAT1通路。并且miR-155-5p模擬物能進一步增強IR-EVs誘導的JAK2/STAT1激活作用。miR-155-5p抑制劑會抑制巨噬細胞中p-JAK2和p-STAT1蛋白升高。這些實驗結果都表明了miR-155-5p通過激活JAK2/STAT1參與IR-EVs調控的巨噬細胞M1型極化。
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          7、IR-EVs能夠導致遠端器官的全身炎癥
          前期實驗已經表明IR-EVs能夠導致心臟的局部炎癥,那么IR-EVs是否在其他器官中發揮作用?研究人員證實了心肌IR損傷觸發了循環中EVs釋放增加,IR損傷促進循環中促炎細胞因子(IL1β和IL6)和趨化因子(Cxcl1和Cxcl2)的分泌,除了心臟組織,在肺、肝、腎、脾等遠處器官中均出現了促炎基因表達增加的情況。GW4869治療減少了IR損傷小鼠的循環中促炎因子和趨化因子的釋放,降低心肌IR誘導的遠處器官的促炎基因表達。
          生物發光成像顯示,對正常小鼠靜脈注射DiR標記的IR-EVs24h后,IR-EVs存在于不同器官中,在循環白細胞及各器官中均檢測到促炎基因表達升高,并且上調了多個器官中CD45+和CD45+F4/80+細胞的表達。表明IR-EVs在心臟IR損傷期間能夠促進全身炎癥反應。
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          小結
          最近的研究強調了細胞外囊泡(EVs)作為細胞間的通信載體在各種疾病的發展中的重要作用,然而對于組織源性EVs的特征和功能知之甚少。該研究通過外泌體外泌體miRNA測序RT-qPCR等技術,揭示了一種基于心臟EVs參與心肌缺血再灌注(IR)損傷機制。IR誘導EVs(IR-EVs)可通過IR-EVs-miR-155-5p-M1極化軸促進炎癥反應,加重心臟炎癥,并且IR-EVs促進局部和全身炎癥,這支持了IR-EVs在心臟炎癥中的作用,以及心臟和其他器官之間的及時通信。GW4869對心臟IR的保護作用提示了早期抑制有害的EVs應該是一種有前途的治療策略。
           
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