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          超詳細圖文版:如何實現m6A測序數據可視化?
          日期:2022年02月25日    來源:云序生物課堂公眾號

          m6A或其他修飾MeRIP測序之后經常會需要通過一種“可視化”方法,直觀考察以及展示到文章中個別基因或區域的測序原始信號(coverage)和序列比對情況,即展示甲基化峰。類似的可視化展示也常常應用在一些其他的需要分析信號峰的測序中,如MeDIP-seqChIP-seqATAC-seq等。今天為大家逐步詳細介紹用IGV軟件進行甲基化峰可視化的操作方法,其中也囊括了一些常見問題的解答 。

          FAQ
          Q1: 測序結果中的位點位置在可視化中全部看不到峰?——注意基因組版本選擇正確(見3.加載基因組)
          Q2: 測序結果中差異位點在IGV中趨勢相反、不明顯?——注意縱軸scale調整統一(見6.調整圖像)
          Q3: 樣品導入不進去?——注意bam文件與bai文件同名、zoom in 放大看結果(見5.導入樣品比對文件)
          Q4: 加載基因組報錯?——(見3.加載基因組)
          Q5: 如何看甲基化峰位在轉錄本什么區域?文獻中peak下方基因轉錄本示意圖是怎么做的?IGV中最下方藍色轉錄本,矩形線形箭頭都代表了什么,怎么看?——(見4.加載注釋文件)
          Q6: 如何將樣品IP和Input重疊起來看?——(見6.調整圖像)

          OUTLINE

          1.獲取IGV軟件

          2.運行軟件

          3.加載基因組
          4.加載注釋文件
          5.導入樣品比對文件
          6.調整圖像
          7.導出圖像

          1、獲取IGV軟件
          方式一:
          云序生物測序報告中:Report>Sequence_Results>Alignment>IGV software中已經提供了IGV_2.4.10版本的軟件壓縮包,解壓后打開可直接點擊igv(.bat)文件運行,無需安裝。
          *如果運行報錯或操作界面錯亂,可能由于java版本不對應,可嘗試方式二下載java included IGV。
          1-1.png
          方式二:
          自行從網站下載:
          http://software.broadinstitute.org/software/igv/download
          1-2.png

          建議選java included的版本。

          下載的版本需要安裝:
          1-3.png
          1-4.png
          1-5.png
          打開點擊igv(.bat)文件運行。
          1-6.png

           
          2、運行軟件
          點擊igv(.bat)文件運行后,等待軟件加載。尤其是電腦上第一次運行時等待時間可能會稍長。
          2-1.png

           加載完畢Loading Genome...框消失,操作界面如下
          2-2.png

           *如果出現如下報錯,原因可能是網絡信號不佳,或IGV服務系連接問題。如果確認網絡狀態正常仍不能解決,可改其他時間嘗試,或自行手動導入自己儲存在本地的基因組(見下文3.加載基因組)。
          2-3.png


          3、加載基因組
          方式一:
          左上角可看到基因組信息,一般軟件初始會默認加載的人類基因組Human hg19版本。如果測序數據分析使用的是其他基因組,需要在此選擇,此處包含了一些常見基因組版本可直接選擇。點擊More有更多的基因組版本可供選擇。務必與測序分析所使用的版本保持一致。
          (云序生物提供的測序服務,使用的基因組版本見報告中:
          Report>Sequence_Results>Supplementary>Sample & groups表格中Genome build)
          3-1.png
          3-2.png

          方式二:
          如果是特殊物種不在此列的(或網絡等原因加載失敗的),則需要自行導入基因組:菜單選擇Genomes>Load Genome from File...
          3-3.png

           打開自己預先儲存在本地的基因組文件。(.fa文件)
          (云序生物提供的特殊物種的測序服務,基因組文件如非客戶提供,可通過銷售提交申請)
          3-4.png
          3-5.png

          4、加載注釋文件
          通常加載完基因組,IGV軟件會自帶該物種Refseq注釋信息,在最下方。
          4-1.png
           
          選擇染色體并且zoom in之后可以看到基因組上各位置的具體基因和轉錄本。
          4-2.png

          轉錄本上線性為內含子區域,藍色矩形為外顯子區域,其中兩端的較窄的矩形為UTR區。轉錄本上箭頭方向向右->->->-,則該基因在正鏈上,左側的UTR區為5’UTR;轉錄本上箭頭方向向左-<-<-<-,則該基因在負鏈上,右側的UTR區為5’UTR。
          4-3.png

          有箭頭間隔不均勻的,說明該基因有多個轉錄本,在此重疊了。可右鍵點擊左側track名(RefSeq Genes)選擇“Expanded”模式查看多個轉錄本的情況。
          4-4.png

          4-5.png

          有時分析所用的注釋文件與IGV默認加載的注釋信息有出入,想要對照自己所用的注釋信息來查看,可將自己使用的注釋文件(.gtf)拖入紅框區域。
          (云序生物提供的測序服務,使用的注釋文件見:Report>Sequence_Results>Alignment)
          4-6.png

          *出現建議建立索引文件的提示,可以點Go等待自動生成索引文件后再次拖動gtf文件進來(推薦),但如果gtf文件是沒有sorted過的(文件名中沒有.sorted.字樣)則無法建立索引文件,如果gtf文件是由云序生物提供的,可聯系銷售。也可以點cancel忽略繼續進行(可能加載會較慢)。
          4-7.png
           
          5、導入樣品比對文件
          前面準備工作做完,要考察樣品的可視化情況,需要樣品比對到基因組后得到的bam文件,并且其對應的索引文件bai文件需要與其存放在同一文件夾中,勿隨意改名,如果一定要改,注意bam與其bai文件前面部分名稱要一致。進行可視化時可以直接使用bam文件,也可以將其轉化為tdf格式文件后使用。
          5-1.png
            方式一:使用bam文件進行可視化
          將bam文件拖入紅框區域。
          5-2.png


          樣品剛拖入右側時,有可能只會顯示灰色字“zoom in to see features”。這只是提示需要放大到一定程度才會顯示出峰。
          5-3.png

           界面上方可以選擇要觀察的染色體、輸入染色體上具體位置或者直接輸入基因名,也可以點“-”和“+”來放大和縮小區域。Bam文件在縮放區域時可能會較慢需要耐心等待。
          5-4.png

           Bam文件加載好后,出現兩條track,上面一條coverage即通常可視化圖中展示的峰形,下面一條track展現的是每一條read在基因組上的比對情況。
          5-5.png

          作圖時可以右鍵點擊track名選擇隱藏這條alignment track,以便讓出位置展示多個樣品中的甲基化峰。
          5-6.png

            
          方式二:使用tdf文件進行可視化
          由于bam文件較大,讀取和調整較慢,可以通過IGV內自帶的IGV Tools將bam文件轉化為tdf文件來進行可視化。相較bam文件,tdf文件去除了alignment track的信息只保留了coverage信息,但文件變小便于快速操作,并且用tdf文件操作時可以進行多樣品疊加展示(見后文6調整圖像)。
          在菜單選Tools>Run igvtools...
          5-7.png

          點擊Input File后面的browse,選擇要轉化的bam文件。
          5-8.png

          選擇好以后,Output File會自動命名,不需要再選擇。點擊Run進行轉化。
          *有時出現WARNING: BAM index file...bam.bai is older than ...bam,是提示這個索引文件bai文件比bam文件生成的時間要早,而正常情況下理當先有bam再建立它的bai文件,因此軟件提醒注意是否文件有誤。一般可能只是由于涉及到原始數據二次下載導致文件生成時間改變,可以忽略這個提示。
          5-9.png

          點擊Run之后等待其轉換,需要一定時間。此時可以看到Run變灰,并且等待一段時間后在Message信息框可以觀察到“..”點逐漸增加,說明正在轉換中。完成后會顯示“100%”和“Done”。
          5-10.png

          生成的tdf文件被保存在bam同文件夾中。在igvtools中重新選擇其他Input File可逐個進行轉換。
          5-11.png

          *若tdf文件大小為0或特別小,說明轉換未完成或不完整,無法使用,嘗試重新進行轉換。
          tdf文件的使用方式同bam一樣,直接將文件拖入IGV。
           
          6、調整圖像
          導入多個樣本后,可以右鍵track名,進行各種調整和操作,將圖像調整到滿意的形式展示。可以自己多多嘗試。下面例舉一些常用的操作供參考。
           右鍵樣品名可以改樣品名(Rename Track)、更改track的高度、顏色、名字字體大小(Change...)等基本操作。
          6-1.png


           要對比多個樣品中甲基化峰時,會需要將各樣品縱坐標scale調整至一致才便于直觀比較。
          6-2.png


          可以 1)根據甲基化峰信號值手動調整個別樣品的scale:右鍵點樣本名選Set Data Range后輸入最大值;
          6-3.png

          2)單個樣品自動調節至合適的scale:右鍵點樣本名選Autoscale,會自動調整到一個可以顯露出該視窗內該樣本最高信號值的scale;
          6-4.png

          3)也可以同時選中要統一的所有樣品名(按住shift或者control點選)然后右鍵選擇Group Autoscale,則全部樣品會被統一采用一個相同的scale。
          6-5.png
          6-6.png
          如果是用tdf文件進行的可視化(見5 方式二),可以將多個樣品overlay后用不同的顏色標示,常用在將樣品的IP與Input重疊展示。同時選中要重疊的track,右鍵選擇Overlay Tracks。Overlay后注意及時重新命名以免混淆。可以分別Change兩個Track的Color (Positive和Negative兩條track).
          6-7.png


          7、導出圖像
          在菜單File>Save Image中導出圖像。
          7-1.png

          有三種文件格式可以選擇。
          7-2.png


           導出的圖片為當前視窗下的全部內容。
          7-3.png

          或右鍵track名,選擇Save Image則僅導出樣品track的圖像。
          7-4.png

          **有文獻IGV可視化圖上下方有其他個性化的注釋信息、圖形,甲基化區域有顏色高亮或框,為IGV外畫圖軟件(PS等)自行添加。
          **IGV中其他詳細信息,可參閱IGV官網http://www.broadinstitute.org/igv/
           
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