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          RNA甲基化之m7G—另辟蹊徑帶你輕松發文!
          日期:2022年03月08日    來源:
          目前RNA修飾研究最多的是m6A甲基化,那么除了m6A,其他的修飾如m7G、m1A、m5C等也是一個研究熱點。云序生物提供多種類型的RNA修飾測序,在不同領域均能找到發文契機。近期,云序客戶東南大學附屬中大醫院章銳鋒課題組和廣東醫科大學張晶晶課題組在BMC Genomics雜志上發表了兩篇關于m7G修飾譜的文章。分別揭示了缺氧性肺動脈高壓中的RNA m7G甲基化譜以及缺氧下斑馬魚腦中甲基化修飾(m7G、m1A、m5C、m6A)情況,為研究缺氧性肺動脈高壓疾病、腦缺氧損傷提供了新的思路。云序生物有幸參與項目當中的m7G-MeRIP-seqm5C-MeRIP-seqm6A-MeRIP-seqm1A-MeRIP-seqMeRIP-PCR以及生信分析。接下來,讓我們看一下如何僅通過測序就能短、平、快的發表一篇RNA修飾文章。

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          一、大鼠缺氧性肺動脈高壓模型中lncRNAs的m7G修飾譜


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          發表期刊:BMC Genomics
          發表日期:2022年1月7日
          研究方法m7G-MeRIP-seqRNA-seqMeRIP-PCR
          樣品類型:大鼠缺氧性肺動脈高壓肺組織(3) vs 大鼠常氧肺組織(3)
          文章鏈接N7-methylguanosine modification of lncRNAs in a rat model of hypoxic pulmonary hypertension: a comprehensive analysis


          技術路線

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          研究內容

          1、缺氧性肺動脈高壓和對照組中lncRNA m7G甲基化的整體修飾特征
          首先對缺氧性肺動脈高壓(HPH)和對照(常氧,N)大鼠的肺組織進行m7G-MeRIP-seqlncRNA-seq,測序結果顯示,兩組間共有255個m7G甲基化峰,僅占兩組所有峰的5.0%,百分比較低,表明兩組間m7G模式存在差異。分析各lncRNA中m7G峰個數的分布,兩組間無顯著差異。進一步分析m7G甲基化的lncRNA外顯子數量,發現在HPH和對照組中,超過30%的總lncRNA包含兩個外顯子。同樣,m7G和非m7G lncRNA主要由兩個外顯子編碼,說明HPH組和對照組的兩個外顯子對lncRNA中m7G甲基化的貢獻最大。

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          2、兩組間差異甲基化lncRNA的長度和分布
          如m7G lncRNA表達的熱圖所示,344個lncRNA中鑒定出353個差異甲基化的m7G位點。其中55%顯著高甲基化,45%顯著低甲基化。對差異甲基化lncRNA的長度分析顯示,高甲基化和低甲基化類型之間存在差異。接下來還分析了差異甲基化lncRNA在染色體上的分布,其中低甲基化的m7G lncRNA主要位于1、5和4號染色體,低甲基化的m7G lncRNA主要位于1、10和3號染色體。

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          3、差異甲基化lncRNA臨近基因的功能分析
          為了闡明差異甲基化lncRNA在缺氧性肺動脈高壓發生發展中的作用,作者還對位于差異甲基化lncRNA臨近基因進行了GO和KEGG通路分析。GO結果顯示,高甲基化lncRNAs臨近基因主要參與補體激活、胞內細胞成分等。位于低甲基化lncRNAs臨近基因主要與蛋白糖基化、肌細胞分化、免疫球蛋白分泌等相關。此外,KEGG通路分析顯示,這些差異甲基化基因主要與金黃色葡萄球菌感染、cGMPPKG信號通路等通路相關。綜上,m7G修飾的lncRNA可能通過以上GO功能和信號通路影響HPH的發生發展。

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          4、RNA-seq分析HPH中的lncRNA表達譜
          通過lncRNA-seq分析了兩組lncRNA的表達情況。共有111個lncRNA在HPH組中顯著差異表達,其中90個上調,21個下調。同樣預測了這些差異表達lncRNA臨近基因的功能。GO分析顯示,差異表達基因主要與免疫效應過程、囊胚形成、、和細胞器膜固有成分顯著相關。此外,KEGG通路分析顯示,主要參與抗原加工呈遞、內吞和吞噬作用以及Wnt信號通路。總之,這些結果表明,HPH中差異表達的lncRNA可能與HPH發病機制相關。

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          5、lncRNA甲基化與表達的關聯分析
          為了探究lncRNA甲基化與表達之間的關系,對m7G MeRIP-seqlncRNA-seq數據進行了聯合分析。重點研究了兩組間均有的767個m7G lncRNAs的表達,以分析缺氧對m7G甲基化修飾的影響。與對照組相比,HPH中發現了189個高甲基化和155個低甲基化的m7G lncRNA,且m7G-lncRNA所占比例大于非m7G-lncRNA。這些結果表明,在缺氧條件下,m7G修飾顯著上調了lncRNA的表達。聯合分析顯示,只有兩個表達上調的lncRNA被高甲基化,LOC102554730(XR_591973)和LOC102555374(XR_592398)。通過構建ceRNA網絡,發現預測的這六個miRNA均與肺動脈高壓相關。

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          6、缺氧肺動脈平滑肌細胞中m7G XR_591973和m7G XR_592398表達上調
          為了進一步證實這一結果,作者驗證了兩種差異表達的m7G lncRNAs在缺氧(1% O2)和常氧(21% O2) 肺動脈平滑肌細胞中的表達。通過MeRIP-PCR技術檢測lncXR_591973和lncXR_592398是否經m7G修飾,結果顯示m7G lncXR_591973和m7G lncXR_592398水平顯著升高,證明了m7G-MeRIP-seq分析的可靠性。
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          總  結
          本研究利用m7G-MeRIP-seqlncRNA-seq技術首次分析了缺氧性肺動脈高壓(HPH)的m7G修飾譜,疾病組與對照組的m7G修飾模式存在顯著差異。缺氧性肺動脈高壓組中,m7G修飾還會影響RNA的表達,與非m7G lncRNA相比, m7G lncRNA顯著上調。重要的是,這是第一次在HPH中發現上調的m7G lncXR_591973和m7G lncXR_592398,這兩種lncRNA均與缺氧性肺動脈高壓病相關,但它們的臨床意義還需要進一步驗證。本研究將有助于揭示m7G修飾在HPH發病機制中的潛在作用。


          二、缺氧條件下斑馬魚大腦中m1A、m5C、m6A和m7G的甲基化圖譜


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          發表期刊:BMC Genomics
          發表日期:2022年2月8日
          研究方法m7G-MeRIP-seqm5C-MeRIP-seqm6A-MeRIP-seqm1A-MeRIP-seqRNA-Seq
          樣品類型:斑馬魚缺氧腦組織 vs 斑馬魚常氧腦組織
          文章鏈接Mapping the m1A, m5C, m6A and m7G methylation atlas in zebrafish brain under hypoxic conditions by MeRIP-seq


          技術路線

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          研究內容

          1、缺氧條件下斑馬魚腦中m1A、m5C、m6A和m7G的甲基化豐度
          為了研究斑馬魚大腦中的mRNA甲基化圖譜以及揭示缺氧誘導后大腦mRNA甲基化修飾的改變,分別采取經常氧或低氧處理的斑馬魚大腦進行RNA-Seqm7G-MeRIP-seqm5C-MeRIP-seqm6A-MeRIP-seqm1A-MeRIP-seq檢測。測序結果顯示,m1A、m5C、m6A和m7G四種RNA甲基化修飾均廣泛分布于斑馬魚腦的mRNA中,其中m1A和m6A修飾水平相對較高。在缺氧條件下,m1A降低、m5C升高;而m6A和m7G變化不大。motif分析發現m1A和m7G mRNA峰都傾向于具有富含GA的基序,但在缺氧和常氧條件下,m5C和m6A motif存在一些差異。

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          2、m1A, m5C, m6A和m7G在mRNA中的分布特征
          為了更好地了解m1A、m6A、m5C和m7G位點在斑馬魚腦組織中的分布,分析了其在基因組上的分布特征。發現m1A和m7G傾向于富集在5’UTR和起始密碼子區域,而m5C富集在CDS區域,m6A富集在終止密碼子附近。此外, m1A豐度在缺氧的CDS區下調,而m5C豐度在缺氧的CDS區上調。m6A豐度無差異,但5’UTR和起始密碼子區域中m7G豐度下調。以上結果表明,在缺氧條件下,斑馬魚腦組織的四種甲基化修飾表現出顯著差異。

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          3、差異表達基因的GO功能以及基因表達與RNA甲基化的關聯分析
          接下來,為了探究缺氧處理后RNA表達水平的變化,對腦組織樣本進行了mRNA-seq。共鑒定出3087個差異表達基因。通過GO功能分析發現這些差異表達基因與斑馬魚大腦發育相關的后腦形態發生期顯著相關。此外,作者還發現與軸突損傷相關的基因表達發生了改變,如Socs3a、Dpysl2b、Neurog1。提示腦損傷可能與缺氧誘導有關。

          接下來,對RNA甲基化和RNA表達進行了關聯分析。隨著基因表達水平升高,這四種修飾的總體水平也逐漸升高。

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          4、斑馬魚腦中高度保守的內部m1A修飾與部分mRNA的剪接有關
          在斑馬魚腦組織中以m1A修飾最為豐富,根據m1A-MeRIP-seq測序結果對差異甲基化修飾的基因進行了GO富集分析。結果顯示這些差異基因主要參與激酶活性、可變RNA剪接、Wnt信號通路等。一項研究指出,在人類基因組中,95%包含多個外顯子的基因都具有選擇性剪接(AS)。因此接下來探究了m1A對RNA剪接的影響,發現下調的m1A甲基化基因更有可能被AS靶向。其中轉錄激活因子ss18和剪接因子srsf7在缺氧組大腦中m1A修飾的豐度較低,這表明m1A修飾可能參與了AS。因此作者推測斑馬魚大腦可能通過改變m1A修飾水平來調節相關基因的表達進而應對缺氧誘導反應。

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          5、3'UTR中m1A、m5C、m6A、m7G與miRNA結合位點的關系
          前面的結果顯示四種修飾均在3’UTR占一定比例。此外,據報道哺乳動物大腦組織有豐富的miRNA,并且可能受m6A調控。因此,作者接下來分析斑馬魚腦組織中miRNA靶向的轉錄本是否更容易甲基化。結果表明, miRNA靶向的5個基因具有m1A、m5C、m6A和m7G甲基化修飾,其中m6A的豐度高于其他修飾。進一步探究顯示miRNA靶選擇的偏好與甲基化修飾有關。綜上所述,mRNA的四種甲基化修飾可能與3’UTR區域的miRNA結合位點有關,其中m6A與miRNA的關系最為顯著。

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          6、斑馬魚腦組織轉錄本中重復元件的分布及其與m1A、m5C、m6A和m7G RNA甲基化的關系
          最近,有報道稱miRNA來源于內源性逆轉錄病毒(ERV)和其他轉座因子。前面的分析顯示,miRNA在斑馬魚腦組織中的分布與RNA甲基化呈正相關。進一步分析發現,大多數ERV家族重復序列之間沒有差異。接下來探究了斑馬魚腦轉錄本中重復元素(REs)的分布,發現REs主要富集在3’UTR區,與miRNA的分布也呈正相關。有研究表明, m6A通過轉錄后修飾調控ERVs的表達。結合測序數據,發現缺氧處理后,大多數REs的m1A和m7G甲基化水平下降,尤其是ERV家族。這些發現為今后研究脊椎動物腦組織中RNA甲基化修飾對ERV的調控提供了新的視角。
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          總  結
          本文利用MeRIP-seqmRNA-seq等技術,分析斑馬魚大腦中mRNA的甲基化修飾情況,展示了斑馬魚腦轉錄組中第一個完整的m1A、m5C、m6A和m7G圖譜,揭示了缺氧條件下這些修飾在mRNA中的分布。隨著基因表達水平的提高,這四種修飾的整體水平也逐漸升高。進一步的生物信息學分析表明,斑馬魚大腦中存在大量的m1A修飾。在缺氧處理的斑馬魚大腦中,m1A的比例降低,影響RNA剪接和斑馬魚內源性逆轉錄病毒。這些數據為進一步研究m1A、m5C、m6A和m7G參與脊椎動物miRNA和重復元件的調控提供了寶貴的資源,并從轉錄組的角度為研究腦缺氧損傷提供了新的思路,有助于揭示一些與低氧損傷相關大腦疾病的表觀遺傳水平的潛在生物標志物。


          云序生物m7G研究五大模塊
          01 m7G RNA修飾測序

          m7G RNA修飾測序

          對m7G RNA甲基化,目前最流行的檢測手段為merip-m7G-Seq技術,適用于m7G RNA甲基化譜研究,快速篩選m7G RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m7G測序:
          • m7G 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)
          • m7G  LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)
          • m7G  Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)
          • m7G  mRNA測序
          • m7G  rRNA測序
          • m7G  circRNA測序
          • m7G  tRNA測序

          02 檢測整體m7G RNA修飾水平

          LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
          精準高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。

          03 m7G RNA修飾上游酶的篩選

          m7G RNA修飾相關酶PCR芯片
          尋找上游直接調控m7G RNA甲基化的甲基轉移酶。

          04 m7G RNA修飾靶基因驗證

          MeRIP-qPCR
          云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。


          05機制互作研究

          RIP-seq/qPCR
          篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
          RNA pull down -MS/WB
          篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
          雙熒光素酶實驗
          驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
          ChIP-seq
          篩選或驗證目標蛋白與DNA互作,研究相應的分子調控機制。


          云序生物優勢
          優勢一:發表10分以上文章最多的RNA甲基化測序服務平臺。云序已累計支持客戶發表65+篇高水平RNA修飾文章,合計影響因子500+,是國內支持發文最多、累計影響因子最高的公司。
          優勢二:至今完成4000+例RNA甲基化測序樣本,全面覆蓋醫口、農口等各類樣本。
          優勢三:全面檢測mRNA和各類非編碼RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。
          優勢四:獨家提供m7G一站式服務:m7G整體水平檢測m7G測序MeRIP-qPCR驗證、RIPRNA pull-down等。
          優勢五:率先研發微量MeRIP測序技術,RNA量低至500ng起。
          優勢六:國內最全的RNA修飾測序平臺,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化測序。

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