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          27分高分文章怎么發?m6A典型思路 + circRNA科研熱點告訴你答案
          日期:2022年03月17日    來源:云序生物課堂-公眾號
          過往研究表明,N6-甲基腺苷 (m6A) 修飾和環狀RNA (circRNA) 在多種癌癥進程中發揮重要作用,包括胃癌 (Gastric Cancer, GC)。然而,circRNA 在GC中的作用機制是否有 m6A 修飾的參與仍然未知。近期,上海交通大學附屬第六人民醫院的研究者們在Molecular Cancer雜志上發表了“METTL14-mediated m6A modification of circORC5 suppresses gastric cancer progression by regulating miR-30c-2-3p/AKT1S1 axis”文章。該文以METTL14為研究對象,發現其可通過m6A修飾介導circORC5調節miR-30c-2-3p/AKT1S1 axis抑制胃癌腫瘤生長,并可能為GC提供潛在的治療靶點。本文當中涉及到的m6A-MeRIP高通量篩選RNA-seqMeRIP-PCRRIP-seqm6A整體甲基化水平檢測(LC-MS/MS)等實驗,云序生物均可提供技術服務。

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          發表期刊:Molecular Cancer
          發表時間:2022年2月14日
          影響因子:IF = 27.401
          文章鏈接:METTL14-mediated m6A modification of circORC5 suppresses gastric cancer progression by regulating miR-30c-2-3p/AKT1S1 axis
           
          研究思路

          技術路線.png

          研究背景

          雖然胃癌 (Gastric Cancer, GC) 的發病率和死亡率在世界范圍內呈下降趨勢,但GC仍然是中國癌癥相關死亡的第三大原因。近幾十年來,GC治療方式迅速發展,如內鏡下切除、靶向治療和免疫治療。但是,由于腫瘤侵襲和轉移,晚期患者的預后仍然很差。因此,了解腫瘤發生的分子機制對GC的早期診斷和治療具有重要意義。
           
          N6-甲基腺苷 (m6A) 是真核mRNA中最常見的化學修飾之一,在癌癥發生發展中起著關鍵作用。m6A甲基化可以被甲基轉移酶催化,如METTL3/14/16 ("writers"),被去甲基化酶去除, 如FTO和ALKBH5 ("erasers"),并與m6A結合蛋白相互作用,如YTHDF1/2/3和IGF2BP1/2/3 ("readers")。過往研究已經表明,METTL14在結直腸癌 (CRC),膀胱癌和乳腺癌中起腫瘤抑制劑的作用,而在甲狀腺癌,胰腺癌和白血病的發生發展中則是致癌因子。目前,METTL14 在GC 中的作用在很大程度上仍不為人所知。
           
          環狀RNA (circRNA) 作為非編碼RNA的一個亞群,其特征在于閉環結構和對RNase R的抗性。越來越多的證據表明,circRNA可以作為miRNA海綿來調節癌癥進展,circRNA也通過這一機制在GC中起作用。我們之前的研究表明,circLARP4和circYAP1抑制了GC的生長,而circDLST則促進了其進展。但是,circRNA 在GC中的作用機制是否有 m6A 修飾的參與仍然未知。
           
          研究內容

          01  METTL14的下調與GC患者生存不良有關

           作者首先分析了TCGA中的RNA-seq數據,并發現在人類GC組織中 METTL14的表達量相對于正常組織降低 (圖1A)。研究者們通過Western blot進一步檢測了10個配對的GC組織樣品中METTL14的蛋白質水平,結果表明與成對的正常樣品相比,METTL14在GC中的表達量顯著下調 (圖1B,C)。進一步采用IHC染色法分析了含有90對GC和正常組織的組織芯片, 驗證了METTL14在GC組織中的下調性 (圖1D)。此外,Kaplan-Meier分析發現,與高METTL14表達的患者相比,低METTL14表達的患者總生存期較差 (圖1E)。同時,研究者們通過從GSE22377中提取TCGA和GC患者的臨床數據,建立了獨立的兩個隊列。與KM分析的結果一致,低METTL14表達的GC患者具有更差的生存率 (圖1E)。綜上所述,METTL14可以很好地反映GC患者的預后。
            圖1. METTL14的下調與GC患者生存不良有關
           圖1. METTL14的下調與GC患者生存不良有關

          02  METTL14的敲降促進了GC的增殖和侵襲

          鑒于METTL14在GC組織中的表達下調,作者推測METTL14可能在GC中起腫瘤抑制作用。研究者們通過RT-qPCR和Western blot檢測了正常胃上皮細胞系 (GES1) 和GC細胞系 (SGC-7901,MKN28,BGC-823,AGS和MGC-803) 中METTL14的mRNA和蛋白質水平,發現METTL14在AGS和MGC-803中高表達,但在SGC-7901中低表達 (圖2A)。因此,為了確定METTL14在GC中的作用,研究者們用siRNA在AGC和MGC-803細胞中建立了METTL14-敲降 (METTL14-KD) 細胞模型,用質粒在SGC-7901細胞中建立了METTL14過表達 (METTL14-OE) 細胞模型,并通過RT-qPCR和Western blot測定了轉染效率 (圖2B)。然后,作者通過MTT和colony formation assay評估了GC細胞的細胞活力和增殖能力。正如預期的那樣,METTL14的敲降顯著促進了細胞活力 (圖2C) 和增殖潛力 (圖2D)。此外,Transwell invasion assay表明,METTL14的下調極大地促進了GC細胞的侵襲能力 (圖2E)。同樣的,相對于對照組,過表達的METTL14對細胞活力 (圖2C),集落形成 (圖2D) 和入侵能力 (圖2E) 表現出抑制作用。
          圖2. METTL14的敲降促進了GC的增殖和侵襲
          圖2. METTL14的敲降促進了GC的增殖和侵襲

          03  METTL14通過對circORC5的m6A修飾起作用

          為了闡明 METTL14 在GC進展中的作用機制,研究者們首先通過m6A整體水平檢測了MGC-803和AGS細胞中METTL14對m6A水平上的影響,結果表明在METTL14-KD的MGC803和AGS細胞中,m6A水平顯著降低 (圖3A)。然后,對m6A環狀RNA 進行MeRIP高通量篩選,顯示與對照組相比,METTL14-KD的MGC-803細胞中有444個circRNA的m6A水平增加,454個circRNA的m6A水平降低 (圖3B)。其中,hsa_circ_0030632、hsa_circ_0047481和hsa_circ_007612是METTL14-KD細胞中m6A水平下調排名前三的circRNA (圖3C)。  MeRIP-qPCR 進一步驗證了hsa_circ_0007612 (circORC5) 的m6A水平在METTL14-KD細胞中降低 (圖3D),而RT-qPCR分析表明,circORC5 的mRNA水平在METTL14-KD細胞中升高 (圖3E)。在功能上,作者發現在MGC-803和AGS細胞中,circORC5刪除降低了集落形成和入侵能力,并抵消了si-METTL14誘導的集落形成和入侵潛力 (圖3F,G)。這些結果表明,METTL14通過對circORC5的m6A修飾起作用。
          圖3. METTL14通過對circORC5的m6A修飾起作用
          圖3. METTL14通過對circORC5的m6A修飾起作用

          04  circORC5定位于細胞質中,且在GC組織中表達上調

          根據環狀RNA相互作用組中的circRNA注釋,hsa_circ_0007612來自線性基因起源識別復合物亞基5 (ORC5),稱為circORC5 (圖4A)。與線性ORC5相比,circORC5在用RNase R外切酶處理后具有更高的穩定性 (圖4B)。 細胞質和核RNA分析表明,circORC5主要定位于MGC-803和AGS細胞的細胞質中 (圖4C)。FISH進一步證實,circORC5的綠色熒光分布主要存在于GC的細胞質中 (圖4D),并且circORC5在GC組織中的表達量與相鄰的正常組織相比有所增加 (圖4E)。
          圖4. circORC5定位于細胞質中,且在GC組織中表達上調
           圖4. circORC5定位于細胞質中,且在GC組織中表達上調

          05  CircORC5在GC中與miR-30c-3p呈負相關

          借助m6A-circRNA profling和miRbase,作者發現了五個miRNA具有與cirORC5結合的潛力 (圖5A)。研究者們分析了這5種miRNA在GC中的表達水平,發現miR-30c-2-3p的表達水平在387個未成對和41個成對的GC組織中具有最顯著的下降 (圖5B)。FISH分析進一步證實,miR-30c-2-3p的表達水平明顯下調,且與GC組織中的circORC5的表達水平呈負相關關系 (圖5C,D)。FISH分析還表明,circORC5也定位于GC組織的細胞質中 (圖5E)。
           圖5. CircORC5在GC中與miR-30c-3p呈負相關
           圖5. CircORC5在GC中與miR-30c-3p呈負相關

          06  CircORC5在GC中充當miR-30c-2-3p的海綿

          miR-30c-2-3p與circORC5的結合位點如圖6A所示。作者發現miR-30c-2-3p模擬物可以降低野生型 circORC5 3'-UTR區的熒光素酶活性,但對突變體 circORC5 3'-UTR區的活性沒有影響(圖6B)。RT-qPCR分析表明,在MGC-803和AGS細胞中,通過敲降circORC5或過表達METTL14,miR30c-2-3p的表達量顯著增加 (圖6C),但miR-30c-2-3p模擬物對circORC5表達無影響。此外,研究者們在MGC-803和AGS細胞中對Ago2進行了RNA免疫沉淀 (RIP),并通過RT-qPCR分析研究了表達Ago2的細胞中circORC5和miR-30c-2-3p的內源性水平。結果表明與input對照相比,Ago2沉淀中的circORC5和miR-30c-2-3p富集 (圖6D),進一步證實了circORC5在GC中充當miR-30c-2-3p的海綿。 
          圖6. CircORC5在GC中充當miR-30c-2-3p的海綿
           圖6. CircORC5在GC中充當miR-30c-2-3p的海綿

          07  METTL14 介導circORC5 調節 miR-30c-2-3p/AKT1S1 axis

          為了驗證METTL14是否介導circORC5調節miR-30c-2-3p表達RT-qPCR分析表明,在MGC-803和AGS細胞中,circORC5的敲降增加了miR30c-2-3p表達,并逆轉了METTL14敲降對miR-30c-2-3p表達的抑制作用 (圖7A)。作者進一步發現,AKT1S1和EIF4B 是miR-30c-2-3p的目的基因,因為miR-30c-2-3p模擬物可以降低野生型AKT1S1和EIF4B 3' UTR區的熒光素酶活性(圖7B,C)。同時,miR-30c-2-3p模擬物可以下調AKT1S1和EIF4B的表達 (圖7D,E)。進一步的Western blot表明,METTL14敲降顯著上調了MGC-803和AGC細胞中的AKT1S1和EIF4B表達,并且這種效果可以通過circORC5敲降逆轉 (圖7E)。
           圖7. METTL14 介導circORC5 調節 miR-30c-2-3p/AKT1S1 axis
           圖7. METTL14 介導circORC5 調節 miR-30c-2-3p/AKT1S1 axis

          08  METTl14抑制體內腫瘤生長

          為了闡明METTl14是否抑制了體內腫瘤的生長,研究者們將對照或METTl14穩定轉染的SGC-7901細胞系注射裸鼠,成瘤后進行檢測。研究發現METTl14轉染SGC-7901細胞誘導的腫瘤體積小于對照組 (圖8A)。而且生長曲線表明,METTl14轉染組的腫瘤呈時間依賴性減小 (圖8B),且與對照組相比,METTl14轉染組腫瘤體積較小,重量較低 (圖8C)。同時,HE和IHC檢測表明,與對照組相比,METTl14轉染組腫瘤增殖標志物Ki-67下調 (圖8D)。綜上所述,METTl14可抑制小鼠體內GC腫瘤生長。
           圖8. METTl14抑制體內腫瘤生長
           圖8. METTl14抑制體內腫瘤生長
           
          小 結

          本文以METTL14為研究對象,首先借助m6A-MeRIP高通量篩選RNA-seq,篩選到下游環狀RNA——circORC5,并進行了MeRIP-circRNA-PCR驗證。然后通過數據庫檢索和RIP等實驗發現circORC5可通過miRNA海綿機制直接結合miR-30c-2-3p,并調控下游基因AKT1S1和EIF4B的表達。隨后通過功能探究發現METTL14可抑制胃癌腫瘤生長。總的來說,本文發現METTL14通過m6A修飾介導circORC5調節miR-30c-2-3p/AKT1S1 axis抑制胃癌腫瘤生長,并可能為GC提供潛在的治療靶點。

          典型思路


          一般性思路.png

          該文章為m6A甲基化修飾circRNA研究提供了典型的思路,從m6A修飾相關酶入手,尋找其在某一體系(疾病)中的異常表達情況,然后通過敲低和過表達該m6A修飾調控蛋白,進行表型檢測和尋找m6A修飾差異化的circRNA進行進一步的分子機制研究。本公司可提供全面化的m6A修飾研究服務,更可借助目前最流行的m6A-MeRIP-seq技術高效篩選靶基因。
           
          云序生物m6A修飾研究五大模塊

          01 m6A RNA修飾測序
          m6A RNA修飾測序(m6A-MeRIP-seq)
          對m6A RNA甲基化,目前最流行的檢測手段為m6A-Seq技術,適用于m6A RNA甲基化譜研究,快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序:
          • m6A 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)
          • m6A LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)
          • m6A Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)
          • m6A  mRNA測序
          • m6A miRNA測序

          02 檢測整體m6A RNA修飾水平
          LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
          精準高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。
          比色法檢測整體RNA修飾水平
          快速檢測m6A整體甲基化水平
          03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
          m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
          尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
          04 m6A RNA修飾靶基因驗證
          MeRIP-qPCR
          云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
          05機制互作研究
          RIP-seq/qPCR
          篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
          RNA pull down -MS/WB
          篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
          雙熒光素酶實驗
          驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
          ChIP-seq
          篩選或驗證目標蛋白與DNA互作,研究相應的分子調控機制。
           
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