頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)嚴重破壞咀嚼、呼吸、吞咽等基本生理功能，甚至可能危及生命。因此探討影響HNSCC腫瘤發生和發展的因素是當前迫切需要解決的問題。m6A修飾的研究為轉錄后調控開辟了新的視角。然而，m6A的修飾狀態及其如何參與HNSCC的進展仍不清楚。2022年4月9日云序客戶上海交通大學附屬第九人民醫院張志愿院士課題組馬海龍研究員在Molecular Cancer雜志（IF=27）上發表了文章“The m6A demethylase ALKBH5 promotes tumor progression by inhibiting RIG-I expression and interferon alpha production through the IKKε/TBK1/IRF3 pathway in head and neck squamous cell carcinoma”，發現了ALKBH5通過IKKε/TBK1/IRF3通路抑制RIG-I表達和干擾素α的產生進而促進腫瘤發生。云序生物有幸參與了該項工作中的m6A MeRIP-seq、RNA-seq以及MeRIP-qPCR驗證服務。下面我們為大家介紹這篇文章的研究思路。
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發表期刊：Molecular Cancer
影響因子：27.401
發表時間：2022年4月9日
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR
文章鏈接：The m6A demethylase ALKBH5 promotes tumor progression by inhibiting RIG-I expression and interferon alpha production through the IKKε/TBK1/IRF3 pathway in head and neck squamous cell carcinoma
技術路線
研究內容
1、在HNSCC中，m6A修飾水平下調和m6A去甲基化酶表達上調與預后不良相關
通過TCGA數據庫分析了m6A writers, erasers, and readers (WERs)在HNSCC中的表達，發現AKLBH5在14個WERs中上調最顯著，是HNSCC中理想的研究對象。此外， HNSCC組與配對正常組織相比m6A修飾百分比下降，大多數HNSCC細胞系的m6A修飾水平低于初級口腔角質形成細胞。因此作者推測HNSCC中m6A的下調可能與去甲基化酶的過表達有關。使用免疫組化技術進一步檢測發現ALKBH5和FTO在HNSCC組織中表達上調，其高表達與HNSCC中TNM晚期和預后不良相關。根據ROC曲線，ALKBH5診斷HNSCC的敏感性為65.7%。5個腫瘤組織中ALKBH5蛋白的表達高于鄰近正常口腔上皮組織。這些結果表明，在HNSCC中，m6A去甲基化酶的表達上調可促進低m6A狀態，并與不良預后相關。
2、抑制ALKBH5可降低體外細胞增殖和體內腫瘤生長
為了探索ALKBH5在腫瘤發展中的作用，在HN4和Cal27細胞中敲低ALKBH5 ，發現顯著降低了細胞增殖和克隆形成。此外，沉默ALKBH5可降低DNA復制活性，且G1期和凋亡細胞的比例也明顯增加。基因集富集分析顯示這些表達變化的基因與細胞周期和DNA復制過程有關。這些結果表明，ALKBH5是一個驅動HNSCC發展的致癌基因。為了進一步確定ALKBH5在腫瘤生長中的作用，在Cal27細胞系中構建了敲低和過表達模型。敲低ALKBH5可以抑制腫瘤生長，而過表達則促進腫瘤生長。此外，TUNEL染色顯示，敲低ALKBH5的表達增加了細胞凋亡，而過表達則降低了細胞凋亡。以上結果表明，ALKBH5在HNSCC的發展中起著非常重要的作用。
3、HNSCC中m6A修飾特征及ALKBH5下游靶點分析
接下來探究ALKBH5促進腫瘤發生的分子機制。首先m6A整體水平檢測發現在HNSCC細胞系中，ALKBH5的缺失增加了m6A的總豐度。然后通過m6A MeRIP-seq和RNA-seq，共篩選出171個差異表達和m6A修飾差異基因。motif分析顯示，GGACU基序在m6A位點高度富集，與m6A序列RACH一致。總體而言，對照組和ALKBH5缺陷細胞分別鑒定出2080和1962個獨有的m6A峰，以及1172和1071個獨有的m6A修飾基因。作者進一步研究了m6A的分布模式，在對照組和ALKBH5缺陷細胞中，總m6A峰和兩組共有m6A峰分布模式相似。有趣的是，CDS區中m6A的相對增加是以一種依賴于ALKBH5的方式。為了探究ALKBH5沉默后下游的生物學過程，對差異表達基因(DEGs)進行功能富集分析。利用聚類分析方法將DEGs分為凋亡、遷移和免疫三個部分進行分析和分組。GO功能分析顯示，DEGs與腫瘤發展過程，如生長的負調控和細胞周期阻滯，以及固有免疫過程，如細胞對I型干擾素和dsRNA的反應相關。
4、ALKBH5通過m6A修飾調控RIG-1的表達
接下來通過qPCR驗證DEGs的表達，包括參與細胞對I型干擾素反應的DEGs。ALKBH5敲除后，DDX58的增加最為顯著，且在細胞系之間相對一致。火山圖顯示，與對照相比，DDX58的mRNA表達和m6A修飾水平相對較高。可視化分析顯示，在DDX58 mRNA的3'UTR區，m6A顯著富集。且MeRIP-qPCR實驗證實，在HN4和Cal27細胞系中，ALKBH5敲除后，DDX58 mRNA的m6A修飾顯著升高。這些結果表明，DDX58是HNSCC中ALKBH5介導的m6A甲基化修飾靶點。
DDX58編碼RIG-I蛋白，RIG-I蛋白是一種識別病毒RNA的細胞質受體，在先天免疫和I型干擾素的產生中起著關鍵作用。敲除ALKBH5顯著增加了RIG-I蛋白表達，說明ALKBH5通過去甲基化活性影響RIG-I的表達。同樣，過表達RIG-I可逆轉ALKBH5介導的抑制。此外，ALKBH5過表達抑制RIG-I介導的IFNα分泌。為了確定依賴于ALKBH5的m6A調控對RIG-I表達的影響，將m6A共識序列中的兩個A突變為C， ALKBH5缺失顯著提高了WT型DDX58的熒光素酶活性，而非突變型。并且通過RNA穩定性實驗發現，在HNSCC細胞中，敲低ALKBH5可提高DDX58的表達，延長DDX58 mRNA轉錄本的半衰期。這些結果表明，ALKBH5介導的DDX58 mRNA m6A水平降低可抑制RIG-I的表達。
5、RIG-1的過表達逆轉了ALKBH5的致癌基因作用
由于RIG-I是ALKBH5的一個新的下游靶點，因此有必要研究RIG-I在ALKBH5致癌基因中的作用。正如預期的那樣，RIG-I的過表達逆轉了HN4和Cal27細胞中ALKBH5過表達引起的細胞增殖和細胞群數量的增加。此外，EdU檢測顯示RIG-I可以降低ALKBH5介導的DNA復制活性。為了進一步支持體外實驗結果，作者還制作了小鼠模型。發現過表達ALKBH5增加了腫瘤的大小和重量，并被RIG-I的表達所抑制。此外，回補RIG-I表達可緩解ALKBH5過表達引起的Ki-67指數的升高和TUNEL陽性百分率的降低。這些結果表明，抑制RIG-1表達是HNSCC中ALKBH5介導的腫瘤發生的關鍵事件。
6、HNRNPC是DDX58 mRNA m6A修飾的“reader”蛋白
為了找到DDX58的“reader”蛋白，并確定DDX58調控的m6A依賴機制，進行了ChIRP-MS實驗。共鑒定出109個蛋白，從7個異質性核核糖核蛋白C (HNRNPC)多肽中鑒定出6個獨特的多肽，它們具有最高的特異性。此外，western blot分析顯示，在ALKBH5沉默后，DDX58探針顯著與HNRNPC結合，并增加m6A水平。RIP-qPCR實驗顯示，HNRNPC抗體與RIG-I結合顯著增加了RIG-I的表達。敲除RIG-I后逆轉了HNRNPC過表達介導的作用，相反，敲除HNRNPC也會抑制RIG-I的表達。這些結果表明，沉默ALKBH5增加了DDX58 mRNA的m6A修飾以及隨后與HNRNPC的結合，促進了DDX58 mRNA的成熟，增強了RIG-I蛋白的表達。
7、由ALKBH5調控的RIG-1通過IKKε/TBK1/IRF3通路影響IFNα的分泌
已有研究報道RIG-1識別病毒RNA，激活IKKε/TBK1/IRF3通路誘導I型干擾素產生。為了探究ALKBH5是否也通過調控RIG-I來影響IFNα的分泌，檢測了RIG-I和IFNα產生的下游信號通路。有趣的是， GSEA分析顯示，ALKBH5沉默后RIG-1樣受體通路和干擾素α/β信號通路顯著富集，表明ALKBH5參與了RIG-I信號轉導和干擾素的產生。在HNSCC細胞系中，RIG-I過表達后IKKε/TBK1/IRF3磷酸化水平升高，酶聯免疫吸附試驗顯示過表達RIG-I后培養液中IFNα分泌增加。此外，過表達 ALKBH5顯著降低了IFNα的分泌，同樣，敲低HNRNPC后也降低了IFNα的分泌。為了探索IKKε/TBK1/IRF3通路的作用，使用IKKε/TBK1特異性抑制劑bay985。這種抑制劑降低了ALKBH5敲低后引起的RIG-I表達的上調和IFNα的分泌。
IFNα作為一種免疫調節細胞因子，在自然殺傷細胞(NK)、T細胞、樹突狀細胞(dc)等免疫細胞的激活中發揮重要作用，并發揮抗腫瘤作用。使用小鼠HNSCC細胞系SCC7在免疫活性C3H/HeJ小鼠體內建立異種移植模型，發現IFNα逆轉了ALKBH5過表達介導的促腫瘤能力。過表達ALKBH5后，血清IFNα濃度降低。此外，ALKBH5沉默后，腫瘤浸潤淋巴細胞中NK細胞、T細胞、DCs和M1巨噬細胞的百分比顯著降低。以上結果表明，HNSCC中過表達ALKBH5可通過調控RIG-I抑制IFNα的分泌，進而抑制免疫浸潤，促進腫瘤進展。
8、AKLBH5表達上調與HNSCC中RIG-1和IFNα表達呈負相關
為了研究ALKBH5/ RIG-I/IFNα調控軸的臨床相關性，使用組織芯片對138例HNSCC標本進行了免疫組化染色。ALKBH5的表達與RIG-I和IFNα的蛋白水平呈負相關，而RIG-I的表達與IFNα的表達呈正相關。這些結果在臨床樣本中驗證了相關性。綜上所述，上調的ALKBH5通過IKKε/TBK1/ IRF3通路抑制RIG-I介導的IFNα分泌，從而在HNSCC中發揮致癌作用，最終減少免疫殺傷細胞浸潤，促進腫瘤進展。
總 結
本研究發現了ALKBH5通過IKKε/TBK1/IRF3通路抑制RIG-I表達和干擾素α的產生進而促進腫瘤發生。采用組織芯片技術檢測HNSCC中m6A去甲基化酶ALKBH5的表達，利用m6A-MeRIP-seq和RNA-seq鑒定ALKBH5的下游靶點，ChIRP-MS技術尋找m6A“reader”蛋白。在此，作者證實了在HNSCC中m6A修飾下調和兩種去甲基化酶上調，沉默去甲基酶ALKBH5會抑制腫瘤進展。此外，ALKBH5下調了DDX58 mRNA的m6A修飾，“reader”蛋白HNRNPC與DDX58 mRNA的m6A位點結合，促進其成熟。而過表達ALKBH5可使C3H免疫小鼠腫瘤浸潤淋巴細胞數量減少，IFNα可使其恢復。在HNSCC患者中，AKLBH5的上調與RIG-I和IFNα表達呈負相關。這些發現揭示了m6A修飾通過ALKBH5/RIG-I/IFNα軸介導的免疫微環境調節的新機制，為在HNSCC中靶向外轉錄組調節因子的治療提供了理論基礎。
云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-meRIP-seq）
對m6A RNA甲基化，目前最流行的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：
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m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
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m6A LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
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m6A Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
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m6A mRNA測序
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m6A miRNA測序
02 檢測整體m6A RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
精準高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法檢測整體RNA修飾水平
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
MeRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。
-- 云序生物服務優勢 --
優勢一：發表10分以上文章最多的m6A RNA甲基化測序服務平臺。云序已累計支持客戶發表71+篇高水平RNA修飾文章，合計影響因子570分+，是國內支持發文最多、累計影響因子最高的公司。
優勢二：至今完成4000+例 m6A測序樣本，全面覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：全面檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：獨家提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。
優勢五：率先研發超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：國內最全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化測序。
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