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          1區,IF=7.561|曹雪濤院士團隊揭秘2’-O-甲基化修飾對先天免疫及病毒感染的影響
          日期:2022年05月20日    來源:
          2’-O-CH3 修飾,即 2’-O-甲基化修飾,是一種常見于 tRNA、rRNA 和 snRNA 的 RNA 修飾類型。由于這種甲基化修飾(記作“m”)可以發生于 A/U/G/C (記作“N”)中的任何一種核苷酸殘基的核糖 2’-OH 上,即可能為 Am/Um/Gm/Cm 中的任意一種,故又被稱為“Nm 修飾”。Nm 修飾可增強核苷酸的疏水性,從而影響 RNA 分子的結構和穩定性,進而調節多種生物學過程。近年來,得益于高通量測序技術的普及,mRNA 上的 Nm 修飾現象也得到了逐步揭示。研究發現,mRNA 上的 Nm 修飾常出現于 5’ 帽子結構下游的第 1、2 位核苷酸殘基上,在 mRNA 的其它區域也有報道發現。然而,Nm 修飾對于免疫細胞的生理功能有何影響,仍然是一片未知的領域。近期,南開大學校長曹雪濤院士領銜的科研團隊發表的論文發現,Nm 甲基化轉移酶 FBL 可通過對 mRNA 的 Nm 修飾來促進病毒感染、抑制先天免疫反應。云序生物有幸參與了此項研究中的 2’-O-甲基化修飾測序(Nm-seq )mRNA 測序以及數據分析。至此,云序生物服務的客戶在RNA修飾研究上面即將實現大滿貫,在m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、 2’-O-甲基化修飾均發表高質量文章。

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          論文標題RNA 2’-O-Methyltransferase Fibrillarin Facilitates Virus Entry Into Macrophages Through Inhibiting Type I Interferon Response
          發表期刊:Frontiers in Immunology (IF=7.561)
          作者院校:南開大學 & 北京協和醫學院
          研究方法RNA 修飾質譜LC-MS2’-O-甲基化修飾測序(Nm-seq )mRNA 測序
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          Nm 修飾示意圖

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          簡化版研究思路圖

          1、病毒感染提升 mRNA 中 Am 修飾的整體水平
          研究者首先在 VSV 病毒(Vesicular Stomatitis Virus)感染的小鼠巨噬細胞 RAW264.7 和未感染的對照組細胞中進行了mRNA 修飾質譜LC-MS,發現核糖 2’-OH 上發生甲基化修飾的腺嘌呤殘基(Am)的比例在病毒感染后顯著上升。研究者進而對 VSV 病毒感染的小鼠巨噬細胞及未感染病毒的對照組細胞進行了 mRNA 的 2’-O-甲基化修飾測序(Nm-seq ),發現了兩組細胞之間存在 6808 個差異 Nm 修飾位點(fold change >=4)。基于組間差異 Nm 修飾位點進行的 GO 分析顯示,分子功能(MF)差異主要集中于翻譯和 RNA 加工,細胞組分(CC)差異主要集中于外泌體、細胞核以及細胞質,生物功能(BP)差異主要集中于核苷酸結合和蛋白質結合等。基于組間差異 Nm 修飾位點進行的 KEGG pathway 分析顯示,差異 Nm 修飾基因主要富集于病毒感染相關的通路當中。Nm 修飾位點在基因內區域的統計顯示,大部分 Nm 位點位于編碼區(CDS)。研究者還對病毒感染組和對照組的 Nm 修飾 motif 進行了分析,發現 Nm 修飾 motif 在病毒感染前后存在差異,說明病毒感染前后可能造成了不同 RNA 分子的豐度改變。以上證據說明,mRNA 的 Nm 修飾可能參與調節病毒感染以及抗病毒免疫過程。
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          2、Nm 甲基化轉移酶 FBL 促進病毒感染
          研究者對 8 種 Nm 甲基化轉移酶(FTSJ1、FTSJ2、FTSJ3、FBL、CMTR1、CMTR2、MRM1、MRM3)進行了 siRNA 敲降實驗的篩選,發現敲降 FBL 可以在 RNA 水平、蛋白質水平以及病毒滴度水平抑制 VSV 病毒對小鼠外周血巨噬細胞的感染。研究者通過查詢 GEO 數據庫發現,系統性紅斑狼瘡病人的 CD19+ B 細胞和 CD4+ T 細胞相比于健康對照組,FBL 的表達量顯著降低,暗示 FBL 可能具有免疫調節的功能。研究者還換用病毒物種以及宿主物種進行了一系列 FBL 敲降后的病毒感染實驗,結果均顯示 FBL 具有促進病毒感染的功能。
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          3、FBL 在感染早期促進 VSV 病毒進入巨噬細胞
          Ⅰ 型干擾素(IFN-I) 和干擾素刺激基因(Interferon Stimulated Genes, ISGs)在抗病毒先天免疫中扮演重要的角色。然而,當發生 VSV 病毒感染時,在 FBL 敲降的小鼠外周血巨噬細胞中,相比于對照組的細胞,IFN- α、IFN- β 以及 IFN-I 信號通路中的其它分子卻并沒有顯著變化。研究者還發現,FBL 敲降也不影響小鼠外周血巨噬細胞的活性。不過,在 VSV 感染后 0h、4h、7h、10h 針對病毒感染相關蛋白分子的 Western Blot 實驗中發現,FBL 敲降可在病毒感染早期抑制 VSV 蛋白的表達。研究者因此進一步進行了 VSV 結合細胞以及進入細胞的檢測,發現 FBL 敲降并不影響 VSV 與細胞的結合,但會抑制 VSV 進入細胞。

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          4 、FBL 在正常生理條件下抑制 ISGs 在巨噬細胞中的表達
          研究者在基因編輯 FBL 敲除雜合子細胞系(Fbl+/-)和對照組細胞(Fbl+/+)做了mRNA 測序(3 vs 3),發現 FBL 敲除細胞中的多個干擾素刺激基因(Interferon Stimulated Genes, ISGs)的表達發生了上調。這種上調現象無需病毒感染作為刺激條件。針對 Ifi44、Oas2、Ifit3、Ddx60、Oasl1、Bst2、Ifit1 等幾個 ISGs 的 RT-qPCR 也發現,這些基因的 mRNA 在 FBL 敲降的細胞中表達水平發生上調。
          因此,作者認為,FBL 在正常生理條件下扮演了免疫抑制劑的角色。當 FBL 被敲降時,一些抗病毒的免疫基因的表達增加,因此抑制 VSV 病毒進入巨噬細胞。
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          5  、敲降 FBL 可通過 IFN-I 信號通路提升 ISGs 表達,從而抑制病毒進入細胞
          早先的研究顯示,IFN-I 可以通過 IFNAR-JAK-STAT 信號通路來誘導 ISGs 的表達。研究者發現,在 IFNAR 沉默的細胞系中,如果再敲降 FBL 的話,將無法提升 ISGs 的表達,也不能抑制 VSV 病毒進入細胞。并且,當人為引入充足的 IFN-β 刺激條件時,即使 FBL 敲降也不能提升 ISGs 的表達水平。綜上所述我們可以得出結論:FBL 是通過 IFN-I 信號通路來起到提升 ISGs 表達水平的作用的。
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          6  、FBL 介導的 RNA 2’-O-甲基化修飾抑制先天免疫系統的激活以及 IFN-I 的表達
          研究者在基因編輯 FBL 敲除雜合子細胞系(Fbl+/-)和對照組細胞(Fbl+/+)中進行了 mRNA 修飾質譜LC-MS,發現 FBL 敲除細胞系中的 Am 修飾比例顯著下降。FBL 細胞中類似的 Nm 修飾比例下降現象也出現在總 RNA 的修飾質譜檢測(5 vs 5)結果當中,且可以被 FBl 過表達載體所逆轉。以上證據說明,FBL 催化了 Nm 修飾的發生。
          據報道,mRNA 的 5’ 帽子結構上的 Nm 修飾可以用于區分內源 RNA 和外源 RNA:在靈長類細胞和小鼠細胞實驗中,缺乏 5’ 帽子結構 Nm 修飾的外源病毒 mRNA 可被細胞識別并弱化(attenuate)。因此,作者推測,在 FBL 敲降的巨噬細胞中,低 Nm 修飾的內源 RNA 可能被誤識別為外源 RNA,從而激活先天免疫系統 IFN-I 相關信號的表達。一系列 mRNA 和蛋白質定量檢測實驗結果都顯示,FBL 敲降的巨噬細胞中 IFN-β 以及抗病毒免疫信號通路的一些分子都發生了上調,印證了作者的猜想。
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          7、FBL 通過 MDA5 介導對 IFN-I 信號和 ISGs 的調控
          MDA5 和 RIG-I 都是常見的病毒 RNA 識別分子。研究者分別構建了 MDA5 和 RIG-I 敲除細胞系,并在此基礎上進行 FBL 敲降實驗,檢測 ISGs 的 mRNA 表達水平以及 VSV 進入細胞后的 mRNA 表達水平。實驗結果發現,在 MDA5 敲除細胞系中,FBL 敲降處理將不會影響 ISGs 的表達,也不會影響 VSV 進入細胞,說明 FBL 作用于 MDA5 的上游。
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          小  結

          綜上所述,作者發現 Nm 甲基化轉移酶 FBL 可催化包括 mRNA 在內的小鼠巨噬細胞 RNA 發生 Nm 修飾。這種 Nm 修飾水平可被 MDA5 識別檢測,如果 FBL 表達受抑制、 Nm 修飾水平降低,則會被 MDA5 解讀為外源 RNA 的信號,激活 IFN-I 相關信號,進而促進 ISGs 的表達,引發抗病毒的先天免疫反應。由于病毒感染可以抑制 FBL 的表達,因此最終可以反過來阻止更多病毒進入細胞。
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          --  云序生物服務優勢  --

          單堿基分辨
          可對2’-O-甲基化修飾進行單堿基定位。
          高通量檢測
          可對全轉錄組范圍內的2’-O-甲基化修飾位點進行高通量地平行檢測。
          全分子覆蓋
          可全面地對mRNA、lncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA等多類RNA分子的2’-O-甲基化修飾位點進行檢測。
          一站式服務
          客戶僅需提供組織或細胞,云序生物一站式完成RNA抽提,樣品預處理,建庫,測序,數據分析全套流程。
          專業的生物信息學分析
          專業的生物信息學團隊,能夠滿足客戶的各類深入數據分析需求。

          云序生物RNA修飾研究五大模塊

          01 RNA修飾測序
          云序生物可提供針對m6Am5Cm1Am7Gm6Amac4CO8GNm 等多種不同的 RNA 修飾類型,對 mRNA、lncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA 等多種類型的 RNA 進行修飾測序。

          02 檢測整體 RNA修飾水平
          LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
          精準高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。
          比色法檢測整體RNA修飾水平
          快速檢測m6A整體甲基化水平
           
          03 RNA修飾上游酶的篩選
          RNA修飾相關酶PCR芯片
          尋找上游直接調控RNA修飾的 Writer/Eraser/Reader 蛋白。
           
          04 RNA修飾靶基因驗證
          MeRIP-qPCR
          云序提供各類不同修飾的MeRIP-qPCR服務,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
           
          05機制互作研究
          5.1  RIP-seq/qPCR
          篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
          5.2 RNA pull down -MS/WB
          篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
          5.3雙熒光素酶實驗
          驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
          5.4 ChIP-seq
          篩選或驗證目標蛋白與DNA互作,研究相應的分子調控機制。
          云序客戶RNA修飾部分論文列表

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