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          1區 IF=9.6 |云序Circle-seq攜手浙江大學研究者探索卵巢*eccDNA研究
          日期:2022年06月16日    來源:
          高級別漿液性卵巢*(HGSOC)是卵巢***侵襲性的亞型,HGSOC患者經常出現轉移,導致預后不良。迄今為止,染色體外環狀DNA(eccDNAs)已被證明參與*癥基因組重塑,但eccDNA在轉移性HGSOC中的作用尚不清楚。2022年4月13日,云序客戶浙江大學醫學院附屬婦產科醫院呂衛國/許君芬課題組在Cell Death & Disease雜志上發表了文章“Global characterization of extrachromosomal circular DNAs in advanced high grade serous ovarian cancer”。本文通過Circle-seq分析探索了HGSOC原發性和轉移性組織中的eccDNA譜,發現eccDNA DNMT1circle10302690-10302961可被視為HGSOC轉移和預后的潛在生物標志物或**臨床靶點。云序生物有幸提供了本文當中的環狀 DNA 測序(circle-seq),RNA-seq環狀 DNA Sanger 測序驗證環狀DNA定量PCR等技術服務。
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          發表期刊:Cell Death & Disease
          影響因子:9.685
          發表時間:2022年4月13日
          研究方法RNA-seqCircle-seq環狀 DNA Sanger 測序驗證環狀DNA定量PCR
          文章鏈接Global characterization of extrachromosomal circular DNAs in advanced high grade serous ovarian cancer
          云序提供服務
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          術路線


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          研究內容
          1、Circle-seq分析檢測HGSOC樣品中的eccDNAs
          為了檢測HGSOC配對的原發組織和轉移組織(HGSOC-M)中的eccDNAs,作者對四對標本進行了環狀 DNA 測序(Circle-seq)分析。圖1列出了Circle-seq分析方法的主要步驟。首先,使用柱層析分離總環狀DNA。分離的樣品用內切酶和限制性核外切酶處理,以去除線粒體環狀DNA和殘留的線性染色體DNA。然后使用φ29 DNA聚合酶通過滾動循環擴增純化后的eccDNAs,擴增產物*終通過高通量測序定位到參照基因組(UCSChg19)進行分析。circle-map軟件分析結果顯示,所有樣本**鑒定出194955個eccDNAs,說明在HGSOC組織中有豐富的eccDNA表達。
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          圖1 Circle-seq示意圖

          2、在HGSOC樣本中檢測到的eccDNAs的特征
          然后,作者對HGSOC原發組織和轉移組織的eccDNA以下特性進行了表征:表達頻率、長度分布、GC含量和基因組分布。首先,作者發現這些eccDNAs來源于所有的染色體(圖2A)。比較每個樣本中eccDNAs的表達頻率,發現在原發**中為32113~48817,在轉移性**中為12871~70530不等。其次,大小分布分析顯示,大小小于1000bp的eccDNAs在HGSOC組織中為優勢亞型。HGSOC原發組織eccDNAs平均大小為388bp,轉移性組織平均大小為379bp,均在316~398bp左右達到峰值(圖2B)。第三,與其他基因組區域相比,原發組織和轉移組織的eccDNA序列中GC含量的富集程度更高(圖2C)。第四,通過將eccDNAs定位到不同的基因組元件(圖2D)、重復元件(圖2E)和不同的染色體(圖2F),探討了eccDNAs的可能起源。在這兩組樣本中,基因豐富的染色體與eccDNA形成頻率之間沒有普遍的相關性(圖2F)。值得注意的是,eccDNAs在5‘UTR區和3’UTR區,以及重復元件如衛星,長分散元件LINEs,和短分散元件SINE處豐富,表明在HGSOC組織中,這些區域而不是高基因豐度區域更優先生成eccDNAs。
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          圖2 在HGSOC樣本中檢測到的eccDNAs的特征

          3、eccDNAs在HGSOC配對的原發和轉移組織中差異表達
          根據Circle-seq測序結果,與HGSOC的原發組織相比,在轉移組織中篩選出464個差異表達的eccDNAs,篩選閾值為|FC|≥2和P<0.05(圖3A)。為了證實eccDNAs的存在,作者采用掃描電鏡顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察了HGSOC樣本以及SKOV3、A2780和OVCAR3卵巢*細胞系中的eccDNAs。可視化清楚地顯示了HGSOC組織和三種卵巢*細胞系中eccDNA直觀的環狀結構(圖3B,C)。
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          圖3 eccDNAs在HGSOC的配對原發和轉移組織中差異表達

           4、驗證在HGSOC原發性和轉移性組織樣本中差異表達的eccDNAs
          作者還通過RNA-seq分析確定了同一原發性和轉移性HGSOC**之間的差異表達基因(DEGs)(圖4A,B)。與原發組織相比,在轉移組織中鑒定得到了219個DEGs,包括91個上調mRNA和128個下調mRNA。此外,將Circle-seq數據與RNA-seq結果進行聯合分析,發現64個改變的候選基因存在重疊(圖4c)。同時,作者對這些差異表達的eccDNAs和mRNA進行GO和KEGG分析,發現這些候選基因的主要潛在下游功能包括代謝調節、血管生成調節和細胞死亡等。根據生物信息學分析預測的*癥相關功能和eccDNAs的表達程度,作者選擇了8個eccDNA進行進一步的研究。這些eccDNA按其基因起源命名,如DNMT1circle10302690-10302961
          此外,作者應用環狀 DNA Sanger 測序來確定檢測到的eccDNAs的連接位點,確定了以下6個eccDNAs的準確基因來源:
          TIAM1circle32908504-32909034/TIAM1circle32908506-32909036
          PKNOX1circle44449654-44450167
          DNMT1circle10302690-10302961
          ABI3BPcircle100704857-100705232
          RORAcircle60976547-60977116/RORAcircle60976549-60977118(圖4D)。
          為了進一步驗證測序結果,作者使用另外20對HGSOC的原發性和轉移性組織進行了環狀DNA定量PCR驗證(圖4E)。結果顯示,DNMT1 mRNA和DNMT1circle10302690-10302961是在HGSOC原發和轉移組織中表達水平變化**的候選基因,因此選擇DNMT1circle10302690-10302961進行進一步研究。
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          圖4 驗證eccDNAs在HGSOC配對的原發和轉移組織中差異表達


          5、與HGSOC的原發組織相比,DNMT1circle10302690-10302961在轉移組織中表達下調
          eccDNA DNMT1circle10302690-10302961由19號染色體反義鏈上的一個DNMT1基因片段(chr19:10302690-10302961)環化形成。為了驗證其特殊的環狀結構,在SKOV3、A2780和OVCAR3細胞系中,對DNMT1circle10302690-10302961進行反向PCR檢測。結果顯示,DNMT1circle10302690-10302961在基因組DNA中沒有出現(圖5A)。在SKOV3、A2780和OVCAR3細胞中,使用特異性cy3標簽探針,也發現了DNMT1circle10302690-10302961的存在(圖5B)。**DNMT1circle10302690-10302961的信號主要在染色體外觀察到,確定了該eccDNA的染色體外特征。然后,作者通過FISH和BaseScope檢測驗證了DNMT1circle10302690-10302961在HGSOC原發和轉移組織中的表達(圖5C,D),證實了與HSGOC的原發組織相比,其表達水平在轉移性組織中**下調。
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          圖5 與HGSOC的原發組織相比,DNMT1circle10302690-10302961在轉移組織中表達下調


          6、DNMT1circle10302690-10302961的減少與HGSOC患者預后不良相關
          采用4個在線數據庫(TCGA、GSE9891、GSE26712和GSE102073)分析DNMT1表達水平與HGSOC患者預后的關系。Kaplan-Meier生存分析顯示,DNMT1的低表達與卵巢*患者的短總生存期(OS)相關(圖6A)。由于eccDNA DNMT1circle10302690-10302961和DNMT1 mRNA在HGSOC轉移性組織中的表達均降低,作者推測DNMT1circle10302690-10302961可能也具有這樣的預后價值。因此,作者通過FISH檢測證實了80例HGSOC患者的FFPE組織中DNMT1circle10302690-10302961的表達水平。根據特異性探針信號的強度和范圍,將所有病例分為DNMT1circle10302690-10302961的低表達組和高表達組(圖6B)。進一步的Kaplan-Meier生存分析顯示,原發性HSGOC**中DNMT1circle10302690-10302961的低表達,與較短的OS(圖6C)和較低的無病生存(DFS)率(圖6D)相關。研究結果表明,DNMT1circle10302690-10302961的減少是HGSOC的一個不良預后因素。
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          圖6 DNMT1circle10302690-10302961的減少與HGSOC患者預后不良相關

          小   結

          本文利用Circle-seq分析得到了HGSOC原發和轉移性組織的eccDNA表達譜,并通過與RNA-seq聯合分析鑒定了一個名為DNMT1circle10302690-10302961的新型eccDNA。與HGSOC原發**相比,DNMT1circle10302690-10302961已被證實是轉移性**中下調***的eccDNA。此外,作者還確定了DNMT1circle10302690-10302961在HGSOC診斷中的臨床價值,即DNMT1circle10302690-10302961的減少與HGSOC患者預后不良相關,它可以作為HGSOC轉移**的一個可靠的臨床**靶點。

          云序生物eccDNA測序

          云序生物是國內*早提供環狀DNA測序服務的公司,早在2018年已啟動了環狀DNA測序技術的開發。2019年,云序率先發布了組織細胞環狀 DNA 測序(circle-seq),并成為A&A Bio**代理(該品牌的環狀 DNA 純化柱被絕大部分環狀DNA高分文章采用)。2020年,云序又相繼發布了體液樣品環狀DNA測序體液樣品環狀DNA甲基化測序服務,均為全國**,并成為國內環狀DNA產品線*全的測序公司。迄今為止,我們已經完成上千例樣品的環狀DNA測序,積累了豐富的項目經驗,樣品類型涵蓋:組織﹑細胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等,物種涵蓋:人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。2021年,云序生物的客戶率先發表國內首批 eccDNA 研究論文,其中更有發表于 Nature Communications 上的高分研究

          云序生物eccDNA相關產品

          組織細胞環狀 DNA 測序

          體液樣品環狀DNA 測序

          體液樣品環狀DNA 甲基化測序

          環狀DNA Sanger 測序驗證

          A&A Biotechnology 環狀DNA 純化柱


          1.組織細胞環狀DNA測序
          云序生物基于circle-seq的方法,采用多種手段包括柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環擴增放大信號,高效地純化和富集環狀DNA,再利用NGS測序和生信分析識別環狀DNA。結合優化的實驗流程,本環狀DNA測序服務具有檢出率高﹑準確性好等優點。

          技術優勢:
          使用原裝A&A biotechnology純化柱高效富集環狀DNA
          滾環擴增放大環狀DNA信號,提高檢出率
          專業的生信分析:詳盡的注釋、豐富的圖表
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          云序生物eccDNA測序實驗示意圖


          2.體液樣品環狀DNA測序
          針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品,云序生物參考盧煜明教授團隊開發的方法,酶切去除線性DNA后,利用Tn5轉座酶,打開eccDNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭,進行建庫及測序。Tn5轉座酶法效率高,損耗低,實現血液循環系統中微量的環狀DNA的檢測。并且本產品能保留環狀DNA的原始表達量,使得不同環狀DNA間的表達量的比較更為準確。
          技術優勢:
          減少DNA損失
          保留原始表達量,不同環狀DNA間表達量比較更準確

          3.體液樣品環狀DNA甲基化測序
          針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品,云序參考盧煜明教授團隊今年研發的方法,酶切去除線性DNA后,利用Tn5轉座酶,打開環狀DNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭,并用酶轉化法將未甲基化的C轉化為U,進行建庫及測序。一次建庫測序中同時檢測樣品中環狀DNA及其甲基化位點的信息。
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          技術優勢:
          一箭雙雕:同時檢測環狀DNA及其甲基化狀況,節約樣品,性價比高
          單堿基分辨的環狀DNA甲基化分析

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          針對測序項目中篩選出的環狀DNA,云序提供sanger測序服務驗證環狀結構。其主要目的在于:為用戶提供一種低成本的擴大樣品量驗證手段,節約實驗成本。通過設計反向引物進行PCR擴增,將覆蓋環狀DNA連接位點的擴增產物進行sanger測序,驗證連接位點處序列。

          5.A&A Biotechnology 環狀 DNA 純化柱
          A&A Biotechnology的純化柱,是絕大部分環狀DNA高分文章中所使用的純化柱。云序生物是該品牌在國內的**總代理。


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