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          環狀RNA研究
          m6A環狀RNA測序
          日期:2018年06月08日    來源:

          技術簡介
          近年來,科學家們發現了一種可逆的RNA甲基化—m6A,即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾(N6-methyladenosine,m6A)。研究發現,m6A是真核生物mRNA上常見的一種轉錄后修飾, m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯,在細胞分化、胚胎發育和壓力應答等過程中起重要作用。
          目前對m6A RNA流行檢測手段為MeRIP-Seq技術,云序生物提供成熟m6A RNA甲基化MeRIP-seq服務,技術原理如下: 將甲基化RNA特異性抗體與被隨機打斷的RNA片段進行共孵育,抓取有甲基化修飾的片段進行測序;同時需要平行測序一個對照(Input)樣本,對照樣本只含有打斷的RNA片段,并不添加RNA甲基化特異性抗體與其共孵育。對照樣本用于消除非特異性抓取甲基化片段的背景。對比免疫共沉淀(IP)樣本和對照樣本(Input)中的序列片段,將RNA甲基化修飾位點定位到轉錄組上,并根據RNA-seq數據,計算樣本中RNA甲基化程度。

          m6A RNA測序實驗流程
          云序生物m6A RNA測序實驗流程

          云序生物RNA甲基化測序產品

          RNA甲基化測序產品

          云序優勢
          一站式服務
          客戶只需提供組織、細胞、體液樣品或RNA,云序生物為您完成從m6A RNA-seq富集,文庫制備,上機測序到數據分析整套服務流程。
          優化的實驗流程
          m6A RNA-seq的富集效率是決定數據質量的關鍵,云序生物m6A RNA-seq實驗采用預驗證的商業化抗體和精心優化的實驗流程,具有極高的效率和特異性。
          嚴格的質控
          云序生物對m6A RNA-seq實驗每一步驟均設有關鍵質控,全程監控實驗質量,保證客戶得到優 質數據。
          專業的生物信息學分析
          云序生物擁有專業的生物信息分析團隊,幫助客戶進行實驗數據的全 面挖掘。
          RNA甲基化測序與轉錄組聯合應用
          可整合RNA甲基化數據和轉錄組數據進行生物信息學關聯分析,揭示RNA甲基化對基因表達調控的影響,深入挖掘RNA甲基化的功能。

          樣品要求
          樣品類型
          細胞、組織或RNA,其他樣本類型請電詢。
          樣品量

          a) 細胞:2×107 

          b) 組織:100 mg-1 g

          c) RNA:30-300 μg(OD260/280:1.6-2.3;RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)

          樣品運輸與保存
          樣品運輸:樣品置于1.5mL離心管中,封口膜封好,干冰運輸。
          樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理,液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存,避免反復凍融。

          數據分析(下列有※表示個性化分析)
          1、識別甲基化富集峰
          通過高通量測序和生物信息分析,識別(p <10-5)甲基化富集的基因組區域。
          注:每個樣品組做一個Input,以去除基因組背景,降低假陽性率


          識別甲基化富集峰


          2、RNA甲基富集峰注釋
          通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋,并根據峰中點相對于已知基因的位置,將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。

          RNA甲基富集峰注釋


          3、RNA甲基化富集峰區域的在基因組中的分布

          根據注釋信息,繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。

          RNA甲基化富集峰區域的在基因組中的分布RNA甲基化富集峰區域的在基因組中的分布

          4、RNA甲基化位點Motif分析
          RNA上甲基化的位點,可能包含某種序列motif。 RNA甲基化酶可能正是通過識別這些motif特異性進行甲基化修飾,從而完成轉錄后調控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點后,獲取序列就能使用生物信息學的手段來搜索這些motif,從而揭示RNA甲基化修飾的機制。

          RNA甲基化位點Motif分析

          5、差異RNA甲基化區域的識別與聚類
          云序生物使用diffRepps軟件進行差異甲基化位點的識別。默認篩選標準為 FDR<=0.05,具體以報告為準。識別樣本間的差異甲基化區,發現與特定表型或疾病相關的甲基化區域。

          差異RNA甲基化區域的識別與聚類

          6、差異甲基化區的GO與信號通路分析
          對差異甲基化基因進行功能分類,并發現明顯富集的功能條目。


          差異甲基化區的GO與信號通路分析


          7、Reads 的分布
          使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS,genebody,TES 等位點的分布情況,可以用來觀察RNA甲基化對 TSS 等位點是否有偏好。

          Reads 的分布

          案例解析

          案例1m6A調控環狀RNA編碼蛋白質

          原文:Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine

          期刊Cell Research 影響因子:15.60

          這篇文章出自中科院王澤峰團隊,證實發生大量的環形RNA可作為mRNA來編碼蛋白,這些環形mRNA通過m6A RNA甲基化修飾驅動非帽依賴性的翻譯機制來參與蛋白編碼過程。該研究進一步拓展了環裝RNA的功能,對蛋白質的來源的多樣性有新的認識,具有十分重要的理論意義。作者借助RIP測序技術,發現與mRNA相比,m6A甲基化修飾在環狀RNA上更普遍。


           m6A調控circRNA編碼蛋白質機制

          1. m6A調控circRNA編碼蛋白質機制

           

          案例2:環狀RNA存在m6A修飾且呈現細胞特異性

          原文:Genome-Wide Maps of m6A circRNAs Identify Widespread and Cell-Type-Specific Methylation Patterns that Are Distinct from mRNAs

          期刊:Cell Reports 影響因子:8.03

          本文通過高通量測序方法檢測到Hela細胞和hESC細胞m6A RNA甲基化譜,發現環狀RNA在兩類細胞中存在。通過生信分析,對比兩種細胞共有及特有的環狀RNA并通過驗證手段(Sanger測序)驗證成環狀位置的序列


           Hela細胞和hESC細胞m6A甲基化譜及序列的驗證

          2. Hela細胞和hESC細胞m6A甲基化譜及序列的驗證


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