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          eccDNA(環狀DNA)測序
          組織細胞環狀DNA測序

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          環狀DNA簡介
          游離于染色體基因組之外的DNA (extrachromosomal DNA,ecDNA)被發現常常以環狀的形式存在,這種形式的DNA被稱為環狀DNA (extrachromosomal circular DNA,eccDNA)。目前也習慣將巨大的環狀DNA(>1Mb)稱為ecDNA, 而將相對較小的環狀DNA稱為eccDNA。
          傳統觀點認為真核基因組通常形成穩定的線性染色體。但最新的研究表明:無論是在正常體細胞還是癌細胞中,都存在大量染色體外環狀DNA。近日,Nature雜志上發表了顛覆性研究成果:在腫瘤中,主要的癌基因轉錄本是直接來自于環狀DNA的,而環狀DNA的染色質是高度開放的,環狀DNA的癌基因能夠大量表達,同時缺乏絲粒,導致不遵照孟德爾定律進行遺傳,這種特性使得環狀DNA是驅動腫瘤異質性的重要機制。由此可見,由于其結構和表達的特異性,環狀DNA可以影響細胞生命活動,促進腫瘤細胞演進和適應性進化,增加了基因組的可塑性和不穩定性。目前,環狀DNA不僅僅可以作為一種新型特異的腫瘤標志物,還在腫瘤發生發展機理研究中發揮著重大的潛在價值。可以預見的是,環狀DNA將迅速成為新的科研熱點,甚至會對傳統遺傳學和基因組學帶來革命性影響。


          環狀DNA形成的機理

          目前研究表明,環狀DNA是從染色體上斷裂、環化或者額外復制產生的序列,其剪切加工機理主要提出有兩種可能:(1)通過染色體異位同源重組環化(intrachromatid ectopic homologous recombination,HR);(2)通過非同源染色體末端連接環化(nonhomologous end-joining,NHEJ)。環狀DNA形成是一個復雜的過程,更多環化方式有待探索。
          環狀DNA 形成模型示意圖
          環狀DNA 形成模型示意圖

          組織細胞環狀DNA測序服務

          云序組織細胞環狀DNA測序服務(Circle-seq),采用多種方法高效地富集和擴增環狀DNA,極大地提高了環狀DNA的檢出率。富集后,通過NGS測序高通量地檢測細胞中所有的環狀DNA分子。并通過嚴謹的環狀DNA生信流程,實現了對環狀DNA準確的識別和詳細的基因注釋。

          云序生物組織細胞環狀DNA測序流程示意圖

          云序生物組織細胞環狀DNA測序流程示意圖


          云序優勢
          環狀DNA檢出率高:
          采用多種方法高效地富集環狀DNA,環狀DNA檢出率高。
          專業的生物信息學分析:
          專業的生物信息學團隊,開發了高效識別分析環狀DNA的算法,滿足客戶的各類深入數據分析需求。
          一站式服務:
          客戶只需提供細胞、組織或基因組DNA,云序生物為您完成從樣品準備、環狀DNA富集、文庫制備、上機測序到數據分析整套服務流程。

          樣本要求
          樣品類型:
          細胞、組織、基因組DNA。其它類型樣品請詳詢。
          樣品量:
          a)細胞 2×107
          b)組織 200 mg
          c)DNA:>=10 μg,溶于無菌水或 TE(PH = 8)(OD 260/280值應在1.7~2.0 之間;RNA 應該去除干凈;不得有其它個體或其它物種的DNA污染)。
          樣品運輸及保存:
          樣品運輸:樣品置于1.5mL Eppendorf管中,封口膜封好,干冰運輸,DNA可用冰袋運輸。
          樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊切塊,液氮凍存后-80℃保存;DNA樣品短期內可-20℃,避免反復凍融。

          數據分析(下列有 * 表示個性化分析)

          1.環狀DNA注釋表格
          測序后首先可以得到一個詳盡的環狀DNA注釋表格,列出每個樣品中檢測到的每個環狀DNA所在的染色體、坐標,長度,表達豐度,相關基因注釋, GO注釋,Pathway注釋等。
          1.環狀DNA注釋表格

          2.長度分布
          對整體或單獨樣本中的環狀DNA的長度進行統計和展示。
          2.長度分布

          3.組間共有和特有環狀DNA*
          對不同分組中共有和特有的環狀DNA個數的統計和展示。
          3.組間共有和特有環狀DNA*

          4.環狀DNA差異表
          不同的樣品分組間可以進行環狀DNA豐度的差異比較,通過差異倍數、p值、關聯基因篩選關鍵的環狀DNA。
          4.環狀DNA差異表

          5.差異環狀DNA聚類圖、散點圖、火山圖
          展示不同樣品分組間環狀DNA的豐度差異。
          5.差異環狀DNA聚類圖、散點圖、火山圖

          6.差異環狀DNA所屬基因的功能分析
          對環狀DNA或差異環狀DNA所屬基因進行GO功能和KEGG通路富集分析。
          6.差異環狀DNA所屬基因的功能分析


          7.染色體分布*

          對整體或單獨樣本中的環狀DNA在各染色體上的數量、密度進行統計和展示。

            7.染色體分布*

          7.染色體分布*




          8.環狀DNA在基因組的分布*
          環狀DNA在不同基因區域、重復序列元件區域分布。

          8.環狀DNA在基因組的分布*

          8.環狀DNA在基因組的分布*


          9.聯合轉錄組關聯分析*
          如果聯合全轉錄組測序,可以將環狀DNA與mRNA進行聯合分析尋找相關性。
          9.聯合轉錄組關聯分析*

          案例解析
          案例1:環狀DNA促進染色質的開放和促癌基因的表達
          原文:Wu, S., Turner, K.M., Nguyen, N. et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature (2019) .
          期刊:Nature 影響因子:43.07
          研究團隊首先結合二代全基因組測序和光學匹配(optical mapping),從序列的角度發現,擴增出來的環狀DNA形成了環狀結構,不僅證實了腫瘤中的環狀DNA確實是環狀的,還證明了環狀DNA的染色質是高度開放的,從而進一步闡釋了環狀DNA能大量表達癌基因和其環狀結構介導的超遠距離相互作用,這也表明了環狀DNA可能形成了新的基因調控回路和在驅動腫瘤異質性的機制研究中發揮著重大的作用。


          案例一
          圖1. 環狀DNA環狀結構介導超遠距離相互作用


          案例2:癌基因與鄰近增強子的環化共擴增
          原文:Morton AR, Dogan-Artun N, Faber ZJ, et al. Functional enhancers shape extrachromosomal oncogene amplifications. Cell. 2019 Nov 27;179(6):1330-1341
          期刊:Cell 影響因子:36.22
          本文作者利用染色體外環狀DNA測序探討了癌基因及其鄰近增強子通過環狀染色體外DNA的形式進行擴增事件,研究過程中發現了EGFR基因在成膠質細胞瘤中存在與其上游約130kb的非編碼序列共同擴增的特征,EGFR基因案例表明腫瘤細胞中的癌基因通過高級擴增與環化而形成的對自身調控活性的增強,是一個十分有效的促癌機制。總之,這項研究綜合利用各項計算分析和實驗手段,首次揭示了增強子在癌基因環化擴增介導的促癌效應中所發揮的重要作用,這一機制也為抗腫瘤和診斷提供新的方向和理論依據。


          圖2. EGFR與鄰近增強子共擴增事件存在于染色體外環狀DNA上
          圖2. EGFR與鄰近增強子共擴增事件存在于染色體外環狀DNA上


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