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          eccDNA(環狀DNA)測序
          環狀DNA Sanger測序

          產品詳情
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          環狀DNA簡介
          游離于染色體基因組之外的DNA (extrachromosomal DNA,ecDNA)被發現常常以環狀的形式存在,這種形式的DNA被稱為環狀DNA (extrachromosomal circular DNA,eccDNA)。目前也習慣將巨大的環狀DNA(>1Mb)稱為ecDNA, 而將相對較小的環狀DNA稱為eccDNA。
          傳統觀點認為真核基因組通常形成穩定的線性染色體。但最新的研究表明:無論是在正常體細胞還是癌細胞中,都存在大量染色體外環狀DNA。近日,Nature雜志上發表了顛覆性研究成果:在腫瘤中,主要的癌基因轉錄本是直接來自于環狀DNA的,而環狀DNA的染色質是高度開放的,環狀DNA的癌基因能夠大量表達,同時缺乏絲粒,導致不遵照孟德爾定律進行遺傳,這種特性使得環狀DNA是驅動腫瘤異質性的重要機制。由此可見,由于其結構和表達的特異性,環狀DNA可以影響細胞生命活動,促進腫瘤細胞演進和適應性進化,增加了基因組的可塑性和不穩定性。目前,環狀DNA不僅僅可以作為一種新型特異的腫瘤標志物,還在腫瘤發生發展機理研究中發揮著重大的潛在價值。可以預見的是,環狀DNA將迅速成為新的科研熱點,甚至會對傳統遺傳學和基因組學帶來革命性影響。


          技術簡介

          針對測序項目中篩選出的環狀DNA,云序提供sanger測序服務驗證環狀結構。通過設計反向引物進行PCR擴增,驗證連接位點處序列。通過反式PCR擴增出來的產物,將覆蓋環狀DNA連接位點的擴增產物進行sanger測序,精確證實連接位點。通過sanger低通量測序,一方面更加嚴謹地核實了所挑選出的環狀的連接位點,第二方面驗證了高通量測序和分析識別環狀DNA的準確性,第三方面可以確認某些高通量測到表達量較低的環狀確實存在。
          云序生物針對環狀DNA的break point設計反向引物
          云序生物針對環狀DNA的break point設計反向引物


          實驗方法

          1. PCR 擴增
          2. 瓊脂糖電泳及膠回收
          3. Sanger 測序及結果分析


          樣本要求

          樣品類型:
          組織、細胞、血清血漿或DNA樣品。
          樣品量:
          a)細胞:2×107
          b)組織:200mg
          c)血清血漿:5mL
          d)DNA:>=10 μg,溶于無菌水或 TE(PH = 8)(OD 260/280值應在1.7~2.0 之間;RNA 應該去除干凈;不得有其它個體或其它物種的DNA污染)。
          樣品運輸及保存:
          樣品運輸:樣品置于1.5mL Eppendorf管中,封口膜封好,干冰運輸,DNA可用冰袋運輸。
          樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊切塊,液氮凍存后-80℃保存;DNA樣品短期內可-20℃,避免反復凍融。


          數據展示

          1. 環狀DNA特異性的junction位點分析
          1. 環狀DNA特異性的junction位點分析

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